Zeocin (博萊霉素)Zeocin即phleomycin D1，中文名稱博來(lái)霉素或者腐草霉素D1，是從輪狀鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的一個(gè)突變體菌株中分離而來(lái)的博來(lái)霉素/腐草霉素(bleomycin/phleomycin)的抗生素家族成員。它對(duì)細(xì)菌、真菌(包括酵母)、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞均有抑制作用和細(xì)胞毒性。

Zeocin是一種堿性、水溶性的、銅離子螯合的糖肽抗生素。Cu2+螯合的Zeocin溶液呈現(xiàn)藍(lán)色，無(wú)活性。當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞后，Zeocin上的Cu2+被還原為一價(jià)銅離子(Cu+)，并被細(xì)胞內(nèi)的巰基化合物(sulfhydryl compound)清除，導(dǎo)致Zeocin被活化，能夠結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)DNA上并使其斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

對(duì)Zeocin產(chǎn)生抗性的蛋白是來(lái)源于印度鏈球菌(Streptoalloteichus hindustanus)的Sh ble基因編碼一種14kDa大小的蛋白，它能夠以一定比率結(jié)合Zeocin，使其不能結(jié)合細(xì)胞DNA，抑制其DNA斷裂活性，從而使細(xì)胞對(duì)Zeocin產(chǎn)生抗性。因此，Zeocin可用來(lái)篩選表達(dá)Zeocin抗性基因的多克隆或單克隆細(xì)胞，或用于相應(yīng)的多克隆或單克隆細(xì)胞的維持性培養(yǎng)。

Zeocin對(duì)于絕大多數(shù)好氧細(xì)胞均有效，常用于細(xì)菌(如大腸桿菌)、真核微生物(如酵母)及動(dòng)植物細(xì)胞的篩選。大腸桿菌篩選推薦濃度為25~50μg/ml (低鹽LB培養(yǎng)基，NaCl濃度不能超過(guò)5g/L)；酵母篩選推薦濃度為50~300ug/ml (YPD或基本培養(yǎng)基)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選推薦濃度為50~1000ug/ml (合適培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞系的類型而不同)。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，應(yīng)針對(duì)不同的細(xì)胞系測(cè)試Zeocin的濃度梯度，以確定最佳使用濃度。

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技術(shù)參數(shù)

1.CAS：11006-33-0

2.分子式：C55H85O21N20S2Cu

3.分子量：1474.03

4.溶解性：H2O: 50 mg/mL

5.結(jié)構(gòu)式：

使用方法

1.細(xì)菌的篩選(以大腸桿菌為例)
（1）使用不含Tn5轉(zhuǎn)座子元件的宿主細(xì)胞DH5和DH10等進(jìn)行篩選
（2）需使用低鹽LB培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨，5g NaCl，5g酵母提取物，調(diào)整pH至7.5，加水定容至1L)以維持Zeocin的活性。
（3）Zeocin篩選的推薦濃度為25~50μg/ml。
2.真菌的篩選(以酵母為例)
（1）適用于釀酒酵母和畢赤酵母。
（2）培養(yǎng)基的選擇：含1M山梨醇的YPD培養(yǎng)基(適用于電穿孔法轉(zhuǎn)染細(xì)胞)；YPD或基本培養(yǎng)基(適用于化學(xué)法轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。調(diào)整培養(yǎng)基pH至6.5~8.0，并選擇使用zui低有效濃度的Zeocin進(jìn)行篩選。
（3）轉(zhuǎn)染方法：需使用電穿孔或鋰離子轉(zhuǎn)染法。不要使用酵母原生質(zhì)球(spheroplasting)進(jìn)行Zeocin抗性的轉(zhuǎn)染及篩選，因?yàn)閆eocin會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)球的*死亡。
（4）Zeocin篩選的推薦濃度為50~300μg/ml。具體濃度與酵母菌株、培養(yǎng)基pH以及離子強(qiáng)度有關(guān)。
3.哺乳動(dòng)物穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選
　Zeocin用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選常用濃度為50-1000μg/ml (平均常用濃度為250-400μg/ml)。影響篩選濃度的主要因素包括離子強(qiáng)度、細(xì)胞類型、細(xì)胞生長(zhǎng)密度以及生長(zhǎng)速率。根據(jù)細(xì)胞類型的不同，需要1-2周可以篩選到Zeocin抗性的細(xì)胞。在篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株之前，需要先確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Zeocin最佳工作濃度。Zeocin的最佳工作濃度需要通過(guò)劑量效應(yīng)曲線來(lái)確定。下表中列出了部分細(xì)胞中Zeocin的篩選濃度范圍以供參考。

表1.部分常見(jiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的Zeocin推薦篩選濃度表

 （1）細(xì)胞對(duì)Zeocin敏感性的確定(殺滅曲線的建立)

①接種細(xì)胞使得細(xì)胞密度約為25%，按照8、16或24個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔(分別為單個(gè)培養(yǎng)孔、復(fù)孔和三復(fù)孔)準(zhǔn)備培養(yǎng)的細(xì)胞，培養(yǎng)24h。
②去除細(xì)胞培養(yǎng)液，換成含不同濃度Zeocin的新鮮篩選培養(yǎng)液(0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000μg/ml)。
③每2-4天更換新鮮的篩選培養(yǎng)液，觀察存活細(xì)胞的比例，選擇在1-2周內(nèi)殺死所有細(xì)胞的zui低濃度作為最佳工作濃度。
（2）篩選Zeocin抗性的穩(wěn)定細(xì)胞株
①按照20%-30%的細(xì)胞密度接種細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜。
②轉(zhuǎn)染攜帶Zeocin抗性基因的質(zhì)粒或感染攜帶Zeocin抗性基因的病毒，同時(shí)設(shè)置沒(méi)有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒或感染病毒的細(xì)胞作為對(duì)照。說(shuō)明：沒(méi)有轉(zhuǎn)染質(zhì)?；蚋腥静《镜募?xì)胞，也需要同樣進(jìn)行轉(zhuǎn)染質(zhì)?；蚋腥静《镜南鄳?yīng)實(shí)驗(yàn)操作。
③轉(zhuǎn)染或感染48-72 h后，換成含有最佳工作濃度的Zeocin (由步驟a中的殺滅曲線確定)的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。如果有必要，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，略稀釋后進(jìn)行篩選培養(yǎng)。
④每2-4天更換含有Zeocin的新鮮篩選培養(yǎng)液。
⑤對(duì)照組正常細(xì)胞100%死亡，Zeocin抗性組中存活的細(xì)胞即為表達(dá)Zeocin抗性基因的細(xì)胞。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行多克隆或單克隆細(xì)胞的篩選。根據(jù)細(xì)胞種類和轉(zhuǎn)染/篩選效率，單克隆細(xì)胞株的形成可能需要一周或更多的時(shí)間。
【注】：若待篩選細(xì)胞對(duì)Zeocin的抗性明顯強(qiáng)于大部分細(xì)胞，則按照以下方法克服此類耐受性：用含Zeocin培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞接種培養(yǎng)，置于37℃孵育2-3 h，使得細(xì)胞貼壁。然后將細(xì)胞置于4℃，2 h。需要使用HEPES作為培養(yǎng)基的緩沖體系。重新將細(xì)胞置于37℃孵育。4℃孵育細(xì)胞的目的是短時(shí)間內(nèi)終止細(xì)胞分化，使得Zeocin能發(fā)揮作用，殺死細(xì)胞。
（3）穩(wěn)定細(xì)胞株的維持培養(yǎng)
可采取如下幾種方式之一來(lái)維持培養(yǎng)穩(wěn)定細(xì)胞株：
①使用含有與上述篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株相同濃度的Zeocin篩選培養(yǎng)液來(lái)維持培養(yǎng)。
②降低Zeocin濃度為篩選濃度的一半進(jìn)行維持培養(yǎng)。
③使用剛好能預(yù)防敏感細(xì)胞生長(zhǎng)但不足以致死的Zeocin濃度來(lái)維持培養(yǎng)(根據(jù)殺滅曲線來(lái)判斷)。

注意事項(xiàng)

1.本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，溶解后，須用一次性針頭濾器過(guò)濾除菌。

3.Zeocin人體有害，操作時(shí)請(qǐng)小心，并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

4.Zeocin對(duì)光敏感，需避光保存于-20℃。含有該抗生素的平板或培養(yǎng)基也需避光保存。

5.高離子強(qiáng)度、酸或堿性都會(huì)抑制Zeocin的活性，該抗生素在過(guò)高或過(guò)低pH及弱氧化劑的條件下不穩(wěn)定，且變性不可逆。在培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，需適當(dāng)降低細(xì)菌培養(yǎng)基的鹽濃度(低鹽LB培養(yǎng)基，NaCl濃度不能超過(guò)5g/L)并調(diào)整pH至7.5，從而使其保持活性。

6.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

7.抗生素不穩(wěn)定，請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)盡快使用。
8.以上數(shù)據(jù)均來(lái)自公開(kāi)文獻(xiàn)，李記生物暫未本產(chǎn)品進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證，僅供參考。

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