Biotin TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品描述
　　細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體 DNA 的降解，這是一個較普遍的現(xiàn)象。這種降解非常特異并有規(guī)律，所產(chǎn)生的不同長度的 DNA 的片段約為 180 bp-200 bp的整數(shù)倍，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀 Ladder 圖譜，Biotin TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit試劑盒采用TUNEL 法，應用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 在凋亡細胞斷裂DNA 的 3′-OH 末端催化摻入生*素(Biotin)標記的dUTP(Biotin-X-dUTP)。隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)特異結(jié)合，后在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞，從而可以通過普通光學顯微鏡觀察并計數(shù)凋亡細胞。由于正常的或正在增值的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3′-OH 形成，很少能被染色。TUNEL 法可以選擇性的對凋亡細胞直接進行原位檢測， 而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細胞，是一種更快速、直接的檢測手段。
訂購信息

產(chǎn)品組分

運輸與保存
藍冰運輸。-20℃避光保存；組分 A、E、G 需避光保存，避免反復凍融。有效期見外包裝。
【注】：組分 A、E、F、G 使用時請佩戴口罩、手套，接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。
實驗材料（自備）
PBS 緩沖液（ pH～7.4）
4% 多聚甲醛in PBS
0.3% H2O2  in PBS（新鮮配制）
70%乙醇（自選）
脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）
操作步驟

1. 樣本準備：
    細胞樣品
   （1）可選：準備一份陰性對照樣本（加入不含TdT酶的TUNEL 反應液）。
   （2）PBS 清洗細胞兩次。
   （3）細胞固定：加入適量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液， 4℃ 放置 30 min。
   （4）PBS清洗細胞兩次。
   （5）通透細胞：加入冰上預冷的 70%乙醇，在-20℃孵育 4 h。細胞能在 70%乙醇中-20℃的條件下保存一周。或者細胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透，室溫放置 20 min。
   （6）PBS 清洗細胞兩次。
   （7）封閉細胞：每孔加入100μL左右的配制于PBS中的0.3 % H2O2溶液，輕敲孔板使其充分覆蓋細胞，室溫避光封閉 30 min，用1×PBS清洗細胞2次。
   石蠟組織切片
   （1）室溫下用二甲苯浸泡石蠟組織切片2次，每次5 min，以*脫掉石蠟。
   【注】：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請在通風櫥中進行此操作。
   （2）室溫下，將切片樣本浸沒于無水乙醇中漂洗2次，每次5 min。
   （3）室溫下，將切片樣本連續(xù)浸沒在不同濃度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每種濃度各漂洗1次，每次5 min。
   （4）室溫下，將切片浸沒于純水中漂洗1次，每次3 min，再將切片浸沒于1×PBS中漂洗1次，每次3 min，用濾紙小心吸干切片樣本周圍多余液體。
   （5）用免疫組化筆在切片樣本周圍描繪樣品輪廓，以便下游通透與標記。
   （6）按1:100的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀釋，使其終濃度為20 µg/mL。每個樣本上滴加100 µL稀釋好的Proteinase K溶液，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育20 min（Proteinase K的孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化）。
   【注】：蛋白酶K可以幫助滲透組織，但延長孵育時間可能導致切片脫落，所以要優(yōu)化孵育時間長短。時間一般為10~30 min，4 µm左右的片子可以用10 min，但30 µm左右的可用30 min。過長易脫片、過短起不到通透效果。
   （7）PBS浸潤清洗切片兩次，每次5 min。
   （8）封閉：加入適量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液（新鮮配制），室溫孵育 30 min，以滅活切片內(nèi)源的過氧化氫酶。
   （9）PBS浸潤清洗切片兩次，每次5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。
   冰凍切片
   （1）將冰凍切片放置于室溫的片架上，室溫20 min，晾干。
   （2）將載玻片浸沒在4%多聚*醛溶液（in PBS）中，室溫固定30 min。
   （3）PBS 浸潤清洗切片兩次，每次5 min。
   （4）用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。
   （5）按1:100的比例， 將2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀釋， 使其終濃度為20 µg/mL。每個樣本上滴加100 µL稀釋好的Proteinase K溶液，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育10 min（Proteinase K 的孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化）。
   【注】：蛋白酶K可以幫助滲透組織，但延長孵育時間可能導致切片脫落，所以要優(yōu)化孵育時間長短。時間一般為10~30 min，4 µm左右的片子可以用10 min，但30 µm左右的可用30 min。過長易脫片、過短起不到通透效果。
   （6）PBS浸潤清洗切片兩次，每次5 min。
   （7）封閉：加入適量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液（新鮮配制），室溫孵育30 min，以滅活切片內(nèi)源的過氧化氫酶。
   （8）PBS清洗樣品3次，每次5min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。
   陽性處理(僅陽性對照進行此步驟，其他樣品直接進行TUNEL反應步驟)
   （1）按1:10的比例用diH2O將10 × DNase I Buffer稀釋成1 × DNase I Buffer備用。
   （2）滴加100 µL 1 × DNase I Buffer到已通透的樣本上，室溫平衡5 min。
   （3）用1 × DNase I Buffer 以1:100稀釋DNase I (2 U/μL)，使其為終濃度20 U/mL的工作液。
   （4）輕輕吸掉多余液體，加入100 μL濃度為20 U/mL DNase I工作液，室溫孵育10 min。
   （5）輕輕吸掉多余液體，PBS清洗樣品2次。
   2. TUNEL 反應：
   （1）配制TUNEL反應液（即用即配）。

（2）每個樣品加入 50 μL TUNEL 反應液，37℃避光孵育 60 min，組織樣本需要 2 h（陰性對照樣品加入不含 TdT 酶的TUNEL 反應液）。
【注】：50μL TUNEL反應液適合涂片、切片或96孔板、48孔板、 24孔板或12孔板的一個孔，如果是6孔板中的一個孔TUNEL反應液建議使用100μL。如果待檢測的樣品為涂片、切片或在24 孔板、12孔板或6孔板中，建議在滴加TUNEL反應液后在樣品上覆上防蒸發(fā)膜，防止TUNEL反應液蒸發(fā)，并且使TUNEL反應液均勻覆蓋樣品。
（3）PBS清洗反應后的樣品3次，每次5 min。
3. Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液的配制：
（1）Streptavidin-HRP工作液的配制（即用即配）：

（2）DAB 顯色液的配制（即用即配）：

4. 樣品顯色：
（1）向樣品滴加 50 μL Streptavidin-HRP 工作液，37℃避光孵育 30 min。 【注】：50 μL Streptavidin-HRP 工作液適合涂片、切片或 96 孔板、48 孔板、24 孔板或 12 孔板的一個孔，如果是 6 孔板，建議使用 100 μL。為防止 Streptavidin-HRP 工作液蒸發(fā)，建議在樣品上覆上防蒸發(fā)膜。
（2）PBS 清洗樣品 3 次，每次 5 min。
（3）向樣品滴加 50 μL DAB 顯色液，室溫孵育 5-30 min 或在顯微鏡下根據(jù)顏色的發(fā)展情況掌握染色時間。 【注】：如果顯色很強可短于 5 min 即停止顯色，如果顯色很弱，可以適當延長顯色時間，甚至顯色過夜。
（4）PBS 清洗樣品 3 次，每次 5 min。
（5）選做：用蘇*素染色液或甲基綠染色液進行細胞核染色。隨后用 PBS 清洗 3 次。
（6）直接光學顯微鏡下觀察。針對石蠟切片，如果需要封片，使用 95%乙醇脫水 5 min，再用 100%乙醇脫水 2 次，每次 3 min，再用二甲苯透明 2 次，每次 5 min。

注意事項
1. 該產(chǎn)品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
3. die dan hua na對HRP有抑制作用，實驗中請勿使用含有die dan hua na的試劑。
常見問題與分析