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Collagenase, TypeI 膠原酶I型使用說明書

發(fā)布時間:2017/11/15      點擊次數(shù):1989

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Collagenase, TypeI 膠原酶I型

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價格(元)

Collagenase, TypeI 膠原酶I型

C5100L0040

100mg

4℃避光

350

 

消化法中常使用的酶有3種:胰蛋白酶、膠原酶以及透明質(zhì)酸酶,透明質(zhì)酸酶多數(shù)情況下與胰蛋白酶或膠原酶聯(lián)合應用;胰蛋白酶作用較強,容易造成平滑肌細胞損壞;膠原酶作用較緩和,能消化細胞間質(zhì)中的膠原纖維以釋放細胞,對細胞損傷小,是*一種可以降解具有三股超螺旋結構的天然膠原纖維的蛋白酶。

膠原酶(Collagenase)從溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)提取的一種酶粗提物,也叫梭菌蛋白酶A(clostridiopeptidase A),不僅含有膠原酶,還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等。這些成分分別能夠有效水解結締組織和上皮組織細胞外基質(zhì)內(nèi)的其他蛋白,多糖和脂質(zhì)。該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制,既操作簡便又可提高細胞成活率,zui終濃度200u/mL,此酶消化作用緩和,無需機械振蕩。

目前商業(yè)化提供的細菌膠原酶主要根據(jù)膠原酶活性的差異,分為四種類型:膠原酶I型,II型,III型和IV型,在應用上有所偏向:1)膠原酶I(Type I Collagenase):含有比較均勻的各種酶活力(包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性)。通常用作上皮細胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細胞的制備;2)膠原酶II(Type II Collagenase):含有更高的梭菌蛋白酶活性,通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來源細胞的制備;3)膠原酶III(Type III Collagenase):含有較低的蛋白酶活性,常用于乳腺細胞的制備;4)膠原酶IV(Type IV Collagenase):含有低胰酶活性,通常用于胰島細胞的制備,或者需要維持受體完整性的細胞制備實驗。

使用方法

1. 膠原酶儲存液的配制

向每管100mg的膠原酶中加入100µL的含Ca2+、Mg2+的HBSS(Hank’s平衡鹽溶液,含Ca2+、Mg2+),輕輕旋渦震蕩使其充分溶解,制備成1g/ml(即1000×)的儲存液。然后用低蛋白結合性的0.22μm的濾膜過濾除菌,分裝成小份量,然后于-20℃避光凍存。

使用前于冰上解凍,避免反復凍融。其用于組織和細胞分散的常用濃度為:0.5-2.5mg/ml,用于軟骨消化的常用濃度為1-2mg/ml,需要根據(jù)特定的實驗條件或者參考相應的文獻資料確定所需的*工作濃度。

2.組織的分離

1)使用無菌手術刀或剪刀將組織切成3-4mm大小的組織塊;

2)利用含Ca2+、Mg2+的HBSS洗滌組織塊數(shù)次;

3)加入足量的含Ca2+、Mg2+的HBSS,使其浸沒組織塊,并加入膠原酶至需要工作濃度;

4)于37℃孵育4-18h。消化時使用水平搖床以及用3mM的CaCl2補充消化可以提高消化效率。

5) 已分散開的細胞可使用不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩篩得,收集備用。未*解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續(xù)孵育;

6)利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細胞數(shù)次;

7)細胞培養(yǎng)液重懸上述細胞,利用自動細胞計數(shù)器或其他方法計算活細胞密度。

8)于細胞培養(yǎng)皿上利用合適細胞培養(yǎng)基接種細胞。

3. 器官灌注

1)向37℃預熱的含Ca2+、Mg2+的HBSS中加入膠原酶,另添加3mM的CaCl2有助于提高分離效率;

2)按照已優(yōu)化的速率對相應的器官灌注膠原酶工作液;

3)將上述過程中回收的灌注液流經(jīng)不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩,從而將已解離的細胞或小片段組織塊與較大團塊分離開來,未充分解離的組織需利用新鮮膠原酶工作液于37℃進一步孵育;

4)利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細胞數(shù)次;

5)細胞培養(yǎng)液重懸上述細胞,利用自動細胞計數(shù)器或其他方法計算活細胞密度。

6)于細胞培養(yǎng)皿上利用合適細胞培養(yǎng)基接種細胞。

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