影響重組腸激酶活性的因素有哪些
更新時(shí)間:2022-07-20 點(diǎn)擊次數(shù):1217
腸激酶(Enterokinase,EK,EC3.4.21.9)是一種異源二聚體形式存在于哺乳動(dòng)物十二指腸內(nèi)的絲氨酸蛋白酶。它能高效專一性的水解工程菌表達(dá)的融合蛋白(識別位點(diǎn)是Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)釋放出目的蛋白,被廣泛用于生物工程制藥的開發(fā)。牛腸激酶由一條結(jié)構(gòu)亞基(重鏈)和一條催化亞基(輕鏈)構(gòu)成,二者以二硫鍵結(jié)合。據(jù)報(bào)道,重組腸激酶輕鏈體外具有全酶的酶切特異性,同時(shí)對基因工程融合蛋白底物的酶切活性較提純的牛腸激酶明顯增強(qiáng)。天然腸激酶來源有限,且從動(dòng)物組織提取的腸激酶易污染其他蛋白,給實(shí)際應(yīng)用帶來了困難。這就要求用基因工程方法生產(chǎn)高純度的腸激酶。重組腸激酶可以切割含有四個(gè)天冬氨酸的賴氨酸羧基端肽鍵:天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-賴氨酸(DDDDK)。可以在較寬pH范圍(4.5-9.5)和較寬溫度范圍內(nèi)有效切割融合蛋白。重組腸激酶可去除位于蛋白質(zhì)N-末端的融合蛋白,以除去不需要的融合標(biāo)簽。
常見影響腸激酶活性的因素:
在>200mM咪唑,或>200mMNaCl,或>5%甘油,酶切效果受影響??蓞⒄找韵峦扑]方法進(jìn)行酶切:
1)為獲得理想酶切結(jié)果,請將樣品透析到25mMTris-HCl8.0緩沖液中,再進(jìn)行酶切。
2)若不便透析,可將樣品稀釋,咪唑含量在100mM以下,NaCl濃度在50mM以下,甘油濃度小于5%以下進(jìn)行酶切,酶的用量與蛋白的比例不變(即1U酶切500µg蛋白)。
3)如果樣品溶液中含有上述成分中的一種或多種,且不便去除,此時(shí)適當(dāng)增加酶量或延長酶切時(shí)間,也可達(dá)到較好酶切效果。