99精品欧美一区二区三区黑,久久久久久久久久久午夜福利,91狠狠人妻久久久久久综合,亚洲欧美日韩一区二区搜索

您好!歡迎訪問和元李記(上海)生物技術(shù)有限公司網(wǎng)站!
咨詢熱線

18616108315

當(dāng)前位置:首頁 > 技術(shù)文章 > PEI細(xì)胞轉(zhuǎn)染液使用方法

PEI細(xì)胞轉(zhuǎn)染液使用方法

更新時(shí)間:2017-05-12      點(diǎn)擊次數(shù):14407

使用方法

  1. 接種細(xì)胞:用膠原酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)(不建議用胰酶)。轉(zhuǎn)染前18-24小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞的鋪板,以便在轉(zhuǎn)染時(shí),貼壁細(xì)胞的密度大約在80%左右。注:培養(yǎng)液中的血清和抗生素不影響轉(zhuǎn)染效率。

    2.   準(zhǔn)備 EZ Trans-DNA 復(fù)合物

        (1)轉(zhuǎn)染前將所有試劑置于室溫10分鐘。下面,以轉(zhuǎn)染24孔板培養(yǎng)皿為例,說明轉(zhuǎn)染的具體方法(如果在別的培養(yǎng)器皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染,各試劑建議使用量見表1.:

       (2)將1 μg 質(zhì)粒DNA稀釋到40 μL無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,用移液槍吹吸3-4次。

       (3)將3 μL EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑稀釋到40 μL無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,用移液槍吹吸3-4次。

      注:無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基是稀釋液,不能使用含血清的培養(yǎng)基(包括Opti-MEM)進(jìn)行DNA和EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑的稀釋!因?yàn)镋Z Trans-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成過程不能含有血清。

       (4)將稀釋好的EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑一次性全部加入到已稀釋好的質(zhì)粒DNA中,立即用移液槍吹吸3-4次。

     注:此混合的順序不能反向進(jìn)行!

      (5)室溫放置10-15分鐘,以形成EZ Trans-DNA復(fù)合物。

表1:不同培養(yǎng)體積對(duì)應(yīng)的待轉(zhuǎn)DNA、EZ Trans、稀釋液用量

培養(yǎng)器皿

培養(yǎng)液體積(mL)

DNA量(μg

EZ Trans (μL)

稀釋液(μL)

48孔板

0.3

0.5

1.5

2 × 25

24孔板

0.5

1

3

2 × 40

12孔板

0.75

1.5

4.5

2 × 60

6孔板

1

3

9

2 × 125

35 mm培養(yǎng)皿

1

3

9

2 × 125

60 mm 培養(yǎng)皿

3

6

18

2 × 250

100 mm 培養(yǎng)皿

9

12

36

2 × 500

3.   轉(zhuǎn)染細(xì)胞

  1. 將上述80 μL EZ Trans-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴入到含細(xì)胞的培養(yǎng)皿中。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿或輕微渦旋,讓EZ Trans-DNA復(fù)合物分散均勻。
  2. 在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后12-18小時(shí),去除含EZ Trans-DNA復(fù)合物的培養(yǎng)液。(若細(xì)胞形態(tài)欠佳,可在轉(zhuǎn)染3-5h后,添加1/2體積的包含30%血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基,在轉(zhuǎn)染12-18小時(shí)后*去除含EZ Trans-DNA復(fù)合物的培養(yǎng)液,用含血清和抗生素的新鮮培養(yǎng)液。)
  3. 轉(zhuǎn)染后zui快7h即可檢測(cè)到轉(zhuǎn)入基因的表達(dá),可根據(jù)需要在24-48小時(shí)內(nèi)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

      注:篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,可在上述操作后(轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后),將細(xì)胞傳代至新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(將細(xì)胞稀釋10倍以上),在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃孵育過夜。在有轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的藥物篩選條件下,約 1~2周可篩選到耐藥性克隆,在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

運(yùn)輸與保存方法

       常溫運(yùn)輸,4℃保存,保質(zhì)期12個(gè)月。

使用注意事項(xiàng)

       質(zhì)粒質(zhì)量:請(qǐng)務(wù)必使用高質(zhì)量轉(zhuǎn)染級(jí)無內(nèi)毒素質(zhì)粒。通過260 nm光吸收測(cè)定DNA 濃度,260nm / 280nm比值確定 DNA 純度(比值應(yīng)該在1.8~2.0的范圍之內(nèi))。如有可能,請(qǐng)通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的完整性。

      細(xì)胞條件:使用適當(dāng)保存和經(jīng)常傳代的健康細(xì)胞。確保培養(yǎng)基沒有被細(xì)菌、真菌或支原體污染。如果細(xì)胞是近期復(fù)蘇的液氮凍存細(xì)胞,請(qǐng)?jiān)谵D(zhuǎn)染前至少傳代兩次。建議使用GIBCO或者李記生物的胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞。

特別提醒

1. 對(duì)于某些類型的細(xì)胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染前兩天鋪板可顯著提高轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)水平。如果選擇轉(zhuǎn)染前兩天鋪板,可適當(dāng)降低鋪板密度,以確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度仍為70~80%。

2. 對(duì)于接觸抑制敏感的細(xì)胞,可適當(dāng)降低鋪板密度。

3. 即使在有蛋白(如10%的血清)存在的情況下,DNA-PEI復(fù)合物仍能轉(zhuǎn)染細(xì)胞,但是DNA-PEI復(fù)合物必須在無蛋白存在的條件下形成。

4. 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來而言,每 1μg DNA 使用 3.0 μL EZ Trans試劑都能獲得較高轉(zhuǎn)染效率。使用者也可嘗試每 1 μg DNA使用 1~4μL體積線性PEI轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行優(yōu)化。

EZ Trans轉(zhuǎn)染液用于不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)用量參考(以96孔板為例)

細(xì)胞型號(hào)

培養(yǎng)基

每孔細(xì)胞數(shù)

DNA的量 

轉(zhuǎn)染試劑量

293H

DMEM

3×104

0.2µg

0.5µL

293FT

DMEM

3×104

0.2µg

0.5µL

293E

DMEM

3×104

0.2µg

0.5µL

293F

DMEM

3×104

0.2µg

0.5µL

COS7

DMEM

1.5×104

0.4µg

0.5µL

hela

DMEM

2×104

0.3µg

0.5µL

Caco2

MEM

3.5×104

0.3µg

0.75µL

BHK21

MEM

2×104

0.2µg

0.5µL

CHO-DG44

DMEM+HT+pro

2×104

0.5µg

0.5µL

RAW264.7

DMEM

3×104

0.2µg

0.5µL

MCF7

MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat

2×104

0.1µg

0.25µL

SW480

IMDM

3×104

0.4µg

0.5µL

MDCK

DMEM

4×104

0.6µg

1µL

CHO-K1

IMDM+Pro

3×104

0.2µg

0.5µL

HepG2

DMEM

3×104

0.5µg

0.75µL

A549

DMEM

2×104

0.3µg

0.5µL

NIH/3T3

DMEM

1.5×104

0.1µg

0.75µL

vero

DMEM

3×104

0.3µg

0.75µL

sf9

SIM SF

5×104

0.4µg

0.75µL

 

 

微信咨詢
地址:上海市浦東新區(qū)紫萍路908弄 傳真:021-50724961
©2024 和元李記(上海)生物技術(shù)有限公司 版權(quán)所有 All Rights Reserved.  備案號(hào):滬ICP備2023007219號(hào)-1
武功县| 武宁县| 安阳县| 台江县| 达日县| 融水| 武邑县| 禹州市| 定州市| 东台市| 光泽县| 平安县| 汉源县| 菏泽市| 彩票| 桂阳县| 喀喇沁旗| 黄大仙区| 沙洋县| 微山县| 施甸县| 高碑店市| 宜川县| 普定县| 萍乡市| 金沙县| 桦甸市| 荥阳市| 张家港市| 南岸区| 崇州市| 营口市| 南昌市| 西藏| 云阳县| 汨罗市| 清苑县| 新竹县| 蕲春县| 乳山市| 陇川县|