使用方法
2. 準(zhǔn)備 EZ Trans-DNA 復(fù)合物
(1)轉(zhuǎn)染前將所有試劑置于室溫10分鐘。下面,以轉(zhuǎn)染24孔板培養(yǎng)皿為例,說明轉(zhuǎn)染的具體方法(如果在別的培養(yǎng)器皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染,各試劑建議使用量見表1.:
(2)將1 μg 質(zhì)粒DNA稀釋到40 μL無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,用移液槍吹吸3-4次。
(3)將3 μL EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑稀釋到40 μL無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,用移液槍吹吸3-4次。
注:無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基是稀釋液,不能使用含血清的培養(yǎng)基(包括Opti-MEM)進(jìn)行DNA和EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑的稀釋!因?yàn)镋Z Trans-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成過程不能含有血清。
(4)將稀釋好的EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑一次性全部加入到已稀釋好的質(zhì)粒DNA中,立即用移液槍吹吸3-4次。
注:此混合的順序不能反向進(jìn)行!
(5)室溫放置10-15分鐘,以形成EZ Trans-DNA復(fù)合物。
表1:不同培養(yǎng)體積對(duì)應(yīng)的待轉(zhuǎn)DNA、EZ Trans、稀釋液用量
培養(yǎng)器皿 | 培養(yǎng)液體積(mL) | DNA量(μg) | EZ Trans (μL) | 稀釋液(μL) |
48孔板 | 0.3 | 0.5 | 1.5 | 2 × 25 |
24孔板 | 0.5 | 1 | 3 | 2 × 40 |
12孔板 | 0.75 | 1.5 | 4.5 | 2 × 60 |
6孔板 | 1 | 3 | 9 | 2 × 125 |
35 mm培養(yǎng)皿 | 1 | 3 | 9 | 2 × 125 |
60 mm 培養(yǎng)皿 | 3 | 6 | 18 | 2 × 250 |
100 mm 培養(yǎng)皿 | 9 | 12 | 36 | 2 × 500 |
3. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞
注:篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,可在上述操作后(轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后),將細(xì)胞傳代至新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(將細(xì)胞稀釋10倍以上),在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃孵育過夜。在有轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的藥物篩選條件下,約 1~2周可篩選到耐藥性克隆,在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
運(yùn)輸與保存方法
常溫運(yùn)輸,4℃保存,保質(zhì)期12個(gè)月。
使用注意事項(xiàng)
質(zhì)粒質(zhì)量:請(qǐng)務(wù)必使用高質(zhì)量轉(zhuǎn)染級(jí)無內(nèi)毒素質(zhì)粒。通過260 nm光吸收測(cè)定DNA 濃度,260nm / 280nm比值確定 DNA 純度(比值應(yīng)該在1.8~2.0的范圍之內(nèi))。如有可能,請(qǐng)通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的完整性。
細(xì)胞條件:使用適當(dāng)保存和經(jīng)常傳代的健康細(xì)胞。確保培養(yǎng)基沒有被細(xì)菌、真菌或支原體污染。如果細(xì)胞是近期復(fù)蘇的液氮凍存細(xì)胞,請(qǐng)?jiān)谵D(zhuǎn)染前至少傳代兩次。建議使用GIBCO或者李記生物的胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞。
特別提醒
1. 對(duì)于某些類型的細(xì)胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染前兩天鋪板可顯著提高轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)水平。如果選擇轉(zhuǎn)染前兩天鋪板,可適當(dāng)降低鋪板密度,以確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度仍為70~80%。
2. 對(duì)于接觸抑制敏感的細(xì)胞,可適當(dāng)降低鋪板密度。
3. 即使在有蛋白(如10%的血清)存在的情況下,DNA-PEI復(fù)合物仍能轉(zhuǎn)染細(xì)胞,但是DNA-PEI復(fù)合物必須在無蛋白存在的條件下形成。
4. 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來而言,每 1μg DNA 使用 3.0 μL EZ Trans試劑都能獲得較高轉(zhuǎn)染效率。使用者也可嘗試每 1 μg DNA使用 1~4μL體積線性PEI轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行優(yōu)化。
EZ Trans轉(zhuǎn)染液用于不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)用量參考(以96孔板為例)
細(xì)胞型號(hào) | 培養(yǎng)基 | 每孔細(xì)胞數(shù) | DNA的量 | 轉(zhuǎn)染試劑量 |
293H | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
293FT | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
293E | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
293F | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
COS7 | DMEM | 1.5×104 | 0.4µg | 0.5µL |
hela | DMEM | 2×104 | 0.3µg | 0.5µL |
Caco2 | MEM | 3.5×104 | 0.3µg | 0.75µL |
BHK21 | MEM | 2×104 | 0.2µg | 0.5µL |
CHO-DG44 | DMEM+HT+pro | 2×104 | 0.5µg | 0.5µL |
RAW264.7 | DMEM | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
MCF7 | MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat | 2×104 | 0.1µg | 0.25µL |
SW480 | IMDM | 3×104 | 0.4µg | 0.5µL |
MDCK | DMEM | 4×104 | 0.6µg | 1µL |
CHO-K1 | IMDM+Pro | 3×104 | 0.2µg | 0.5µL |
HepG2 | DMEM | 3×104 | 0.5µg | 0.75µL |
A549 | DMEM | 2×104 | 0.3µg | 0.5µL |
NIH/3T3 | DMEM | 1.5×104 | 0.1µg | 0.75µL |
vero | DMEM | 3×104 | 0.3µg | 0.75µL |
sf9 | SIM SF | 5×104 | 0.4µg | 0.75µL |
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